10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

解決單細(xì)胞分離捕獲、極低量 RNA 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增

產(chǎn)品介紹

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Single cell RNA sequencing）是在單細(xì)胞水平對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)，可以研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況，同時(shí)解決用組織樣本測(cè)序無法解決的細(xì)胞異質(zhì)性難題，讓解析單個(gè)細(xì)胞的行為、機(jī)制及其與機(jī)體的關(guān)系成為了現(xiàn)實(shí)。

10 X Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)利用微流控、油滴包裹和Barcode標(biāo)記等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞捕獲技術(shù)，能夠一次性分離、并標(biāo)記500–10000個(gè)單細(xì)胞，從而獲得每個(gè)細(xì)胞的3’端的轉(zhuǎn)錄組信息。具有細(xì)胞通量高、建庫(kù)成本低、捕獲周期短等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)主要用于細(xì)胞分型和標(biāo)記因子的鑒定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群體的劃分與細(xì)胞群體間基因表達(dá)差異的檢測(cè)，此外該技術(shù)還可以預(yù)測(cè)細(xì)胞分化與研究發(fā)育軌跡，在當(dāng)下疾病、免疫、腫瘤領(lǐng)域以及組織、器官、發(fā)育研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

10X genomics工作原理流程

Gel Bead-In-EMulsions

10X genomics信息分析流程

單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)系統(tǒng)集成：細(xì)胞分離捕獲，微流控芯片擴(kuò)增，數(shù)據(jù)分析。解決單細(xì)胞測(cè)序兩大難點(diǎn)：?jiǎn)渭?xì)胞分離捕獲，極低量 RNA 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。整體的項(xiàng)目流程從樣品接收到項(xiàng) 目交付如下圖：

結(jié)果展示

細(xì)胞分化軌跡分析示例圖

Marker gene鑒定示例圖

細(xì)胞亞群鑒定示例圖

tSNE降維聚類分析示例圖

常見問題

如何確定 cluster 的具體細(xì)胞類型？

1、根據(jù)已知的 marker gene 來確定：根據(jù)之前的經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)記載，已知某一些細(xì)胞類型會(huì)特異表達(dá)一些 marker gene，比如 T 細(xì)胞中特異表達(dá)的 CD3/CD4，B 細(xì)胞中表達(dá)的 CD19/CD20 等。

1)根據(jù) marker gene 在 cluster 細(xì)胞中的表達(dá)情況來確定：利用 Loupe Cell Browser 或其他軟件，標(biāo)記 cell 中表達(dá) marker gene 的情況，來推測(cè)哪個(gè) cluster 是某種細(xì)胞類型。

2)根據(jù)軟件鑒定到的差異表達(dá)基因或者 marker gene 來確定：Cell-Ranger 與 monocle2（或其他單細(xì)胞分析軟件）均提供 cluster 差異表達(dá)基因的結(jié)果，如果已知某種細(xì)胞的Marker gene，可以在差異基因列表中尋找，是否存在這些 marker gene，從而推測(cè)該cluster 是否為某種細(xì)胞類型。

2、根據(jù)基因所在功能通路確定：不清楚具體的 marker gene，或者某些 cluster 找不到已知的 marker gene。根據(jù)cluster 中差異基因或者共表達(dá)基因所在 KEGG 和 GO 通路，推測(cè)細(xì)胞的功能。

擬時(shí)間分析有何用？

在很多生物進(jìn)程中，細(xì)胞并不是全部同時(shí)處于同一個(gè)時(shí)期的。利用單細(xì)胞基因表達(dá)研究細(xì)胞分化時(shí)，捕獲到的細(xì)胞通常處于范圍較廣的不同時(shí)期：某些細(xì)胞細(xì)胞還未開始分化，某些處于中間狀態(tài)，而另一些可能已經(jīng)分化結(jié)束。所以整體看來，樣品中的各個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)波動(dòng)較大，研究起來十分復(fù)雜。擬時(shí)間分析根據(jù)基因表達(dá)量信息，計(jì)算細(xì)胞與細(xì)胞時(shí)間的距離，估算出將所有細(xì)胞排列到其擬時(shí)間進(jìn)程后的總最短路徑，幫助了解樣品中細(xì)胞的種類與細(xì)胞分化的過程。

報(bào)告中 Cell-Ranger、monocle2 或其他軟件的分析結(jié)果是什么關(guān)系？

各個(gè)軟件的分析是獨(dú)立的，雖然其中的具體分析內(nèi)容存在交集，比如細(xì)胞聚類，差異基因鑒定，功能注釋等，但不同軟件的算法是不一樣的，在查看結(jié)果進(jìn)行后續(xù)解讀時(shí)，切記不要弄混。

Cell-Ranger 是 10x 官方提供的分析軟件，其結(jié)果主要包括在原始的網(wǎng)頁報(bào)告中，分析內(nèi)容較少，而且可修改以及定制化分析的余地較?。籱onocle2 是目前主流的單細(xì)胞分析軟件包，由華盛頓大學(xué)的 Cole Trapnell（之前 TopHat 和 Cufflinks 的作者）開發(fā)，涵蓋單細(xì)胞分析中的絕大部分，腳本相對(duì)較為靈活，可根據(jù)具體的要求對(duì)參數(shù)和方法進(jìn)行修改，以獲得最佳的結(jié)果；此外，還可以提供 SC3 軟件的分析，根據(jù)后續(xù)項(xiàng)目個(gè)性化的要求，對(duì)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，或者重分析。

不同軟件的分析內(nèi)容，結(jié)果展現(xiàn)形式，均存在一定的差異，具體采用哪一套分析的結(jié)果，主要依賴客戶根據(jù)自身要求，以及結(jié)果與預(yù)期的相符合程度進(jìn)行挑選。