小鼠腸道微生物多樣性成功案例–蜂膠能預(yù)防結(jié)腸炎嗎？

膳食中加入富含多酚的蜂膠可以預(yù)防結(jié)腸炎，那么中國(guó)蜂膠（CP）和巴西蜂膠（BP）對(duì)腸道的影響效果是否一樣吶？腸道菌群多樣性給你答案！

研究背景

炎癥性腸?。↖BD）主要包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結(jié)腸炎（UC）兩種類型，是一種慢性的胃腸道疾病。盡管IBD的病因還不清楚，然而環(huán)境因素和遺傳因素都會(huì)導(dǎo)致腸上皮屏障的功能障礙，并且與腸道菌群失調(diào)和粘膜炎癥也有關(guān)。腸道微生物與結(jié)腸炎的關(guān)系非常密切。研究發(fā)現(xiàn)，UC患者腸粘膜中的擬桿菌（Bacteroides spp）豐度較高，通過(guò)飲食調(diào)節(jié)提高腸道菌群的多樣性和粘膜的免疫系統(tǒng)，已為IBD的預(yù)防和治療帶來(lái)可能。

多酚是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有典型的芳香或酚環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有抗氧化和抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，綠茶、漿果和咖啡等食物中都含有多酚。蜂膠是蜜蜂從多酚植物中采集的樹(shù)脂物質(zhì)，含有黃酮和酚酸等300多種多酚化合物，目前已經(jīng)被傳統(tǒng)醫(yī)藥行業(yè)廣泛應(yīng)用。巴西和中國(guó)是生蜂膠的兩大出口國(guó)，中國(guó)的生蜂膠主要來(lái)自楊樹(shù)（Populus sp），巴西的生蜂膠主要來(lái)自酒神菊樹(shù)（Baccharis dracunculifolia?DC），研究表明，國(guó)產(chǎn)蜂膠對(duì)右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的大鼠急性結(jié)腸炎具有一定的保護(hù)作用，巴西蜂膠也能使IBD患者受益。然而，不同地理位置和植物種類的蜂膠多酚組成不同，中國(guó)蜂膠和巴西蜂膠的多酚成分可能也具有差異。盡管它們?cè)谥嗵且鸬募毙愿螕p傷、炎癥因子表達(dá)的抑制、腫瘤壞死受體相關(guān)因子（TRAF-6）依賴標(biāo)準(zhǔn)NF-κB通路抑制方面具有生物等效性，然而在IBD相關(guān)的腸胃生理過(guò)程中的生物等效性仍不清楚。

本文旨在研究不同多酚組成的中國(guó)蜂膠（CP）和巴西蜂膠（BP）對(duì)右旋糖酐硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎是否起到保護(hù)作用。

材料與方法

1、采用HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析蜂膠中27種多酚化合物。

2、大鼠分組（共4組，每組8只）：

①正常組（Control）：飼喂常規(guī)飼料；②對(duì)照組（DSS）：飼喂常規(guī)飼料；③處理組1（CP）：飼料中添加中國(guó)蜂膠（蜂膠溶解在0.5%黃芪膠）；④處理組2（BP）：飼料中添加中國(guó)蜂膠（蜂膠溶解在0.5%黃芪膠），除了正常組，其余3組的飲用水添加了DDS（3%）。

3、疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）根據(jù)體重變化、糞便硬度、直腸出血和整體狀況（包括活力、毛皮狀況、姿勢(shì)和行為）進(jìn)行綜合評(píng)分。

4、組織病理學(xué)分析：選擇末端結(jié)腸組織，H&E染色，TUNEL法檢驗(yàn)細(xì)胞凋亡。

5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）：末端結(jié)腸粘膜組織的白細(xì)胞介素（IL-1β）、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）、白細(xì)胞介素（IL-6）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）基因表達(dá)。

6、結(jié)腸炎氧化應(yīng)激：結(jié)腸粘膜組織的過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化活性（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)。

7、微生物多樣性高通量測(cè)序：盲腸內(nèi)容物（150 mg/樣），16S rDNA V3-V4，Illumina PE250，RDP數(shù)據(jù)庫(kù)，生物信息分析：百邁客微生物多樣性云平臺(tái)（BMK Cloud online）。

結(jié)果與討論

1、蜂膠中的多酚特征

從圖1a來(lái)看，CP比BP的多酚化合物種類更豐度，CP的咖啡酸苯酯（29.48 mg/g）含量較高，BP的阿特匹林C（25.6 mg/g）含量較高。

圖1. a：HPLC-DAD/Q-TOF-MS檢測(cè)27種多酚在CP和BP中的濃度；b：DSS、CP和BP組大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（ADI）；c：對(duì)照組、DSS、CP和BP組大鼠的直腸長(zhǎng)度。

2、蜂漿緩解了DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎

葡聚糖硫酸鈉（DSS）導(dǎo)致了大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）升高，體重減輕，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯變短。與DDS（對(duì)照組）相比，CP和BP組均顯著提升了大鼠的DAI值（p＜0.05，ANOVA）（圖1b），減緩了DSS誘導(dǎo)的腸炎癥狀，緩解了體重減輕，顯著抑制了結(jié)腸短縮（p＜0.05）（圖1c）。

3、蜂漿緩解了結(jié)腸損傷

DSS組的大鼠末端結(jié)腸組織產(chǎn)生了明顯的損傷，隱窩產(chǎn)生缺損，白細(xì)胞發(fā)生滲透；CP和BP組的大鼠結(jié)腸組織的壞死和潰瘍較少（圖2A; 2B）。DSS組的大鼠結(jié)腸上皮TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多，然而DP和BP組中的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯較少（圖2C; 2D）。

圖2. CP和BP對(duì)大鼠結(jié)腸組織的損傷修復(fù)。A：末端結(jié)腸HE染色；B：組織病理半定量分值（結(jié)腸損傷、白細(xì)胞滲透）；C：結(jié)腸細(xì)胞凋亡的組織學(xué)切片鏡檢；D：TUNEL法檢驗(yàn)結(jié)腸細(xì)胞凋亡（個(gè)數(shù)/面積）。

4、蜂漿影響了結(jié)腸炎相關(guān)基因的表達(dá)

與DSS組相比，CP和BP組的大鼠結(jié)腸炎癥因子IL-1β、MCP-1和IL-6基因表達(dá)顯著降低（p＜0.05），BP組的TGF-β基因表達(dá)顯著升高（p＜0.05）（圖3A-D）。

圖3. CP和BP對(duì)大鼠結(jié)腸炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響。A：白細(xì)胞介素（IL-1β）；B：?jiǎn)魏思?xì)胞趨化蛋白（MCP-1）；C：白細(xì)胞介素（IL-6）；D：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）。

5、蜂漿對(duì)結(jié)腸炎氧化應(yīng)激的影響

與DSS組相比，CP和BP組的大鼠結(jié)腸炎癥氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量顯著降低（p＜0.05），CP組的T-AOC含量顯著升高（p＜0.05）、SOD含量顯著降低（p＜0.05），BP組的CAT含量顯著升高（p＜0.05）（圖4A-D）。

圖4. CP和BP對(duì)大鼠結(jié)腸炎癥氧化應(yīng)激的影響。A：過(guò)氧化氫酶（CAT）；B：超氧化物歧化酶（SOD）；C：總抗氧化活性（T-AOC）；D：丙二醛（MDA）含量。

6、蜂漿對(duì)盲腸微生物多樣性的影響

CP組的腸道中含有719種獨(dú)特OTU（圖5A），與BP組和DSS組的菌群結(jié)構(gòu)存在明顯的差異（圖5B）。與其他3組相比，CP組的擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）顯著較低，α-變形桿菌（alphaproteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）、Solibacteres、芽單胞菌（gemmatimonadetes）、酸微菌（Acidimicrobiia）和鞘脂桿菌（Sphingobacteriia）僅存在于CP組中（圖5C; 5D）。單胞菌（Gemmatimonadaceae）、Gemmatimonadales、紅螺菌（Rhodospirillales）和黃單胞菌（Xanthomonadales）在CP組中顯著較高，擬桿菌屬（Bacteroides）和Bacteroidaceae在BP組中顯著較高（圖6A; 6B）。相關(guān)性分析表明，Bacteroides（r=0.86，p=0.001）、Ruminiclostridium（r=0.43，p=0.035）和Ruminiclostridium?9（r=0.576，p=0.003）與組織學(xué)指數(shù)顯著正相關(guān)（圖2B）。CP和BP組的Bacteroides.spp相對(duì)豐度顯著高于DSS組（p＜0.05）。

圖5. CP和BP對(duì)大鼠結(jié)腸炎癥腸道微生物的影響。A：韋恩圖；B：PCoA分析（基于weighted UniFrac的組間樣品差異分析）；C：豐度聚類熱圖；D：豐度柱狀圖（“門”水平的前15個(gè)物種）。

圖6. 大鼠腸道微生物的LEfSe分析。A：物種分類進(jìn)化分支圖（LDA＞4）；B：關(guān)鍵物種的相對(duì)豐度熱圖；C：Bacteroides spp的相對(duì)豐度。

結(jié)論

盡管中國(guó)蜂膠（CP）和巴西蜂膠（BP）的多酚組成不同，產(chǎn)生的生理效應(yīng)也不同，然而它們均顯著降低了擬桿菌（Bacteroides spp）的種群豐度，從而對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎起到了的相似的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)：

Wang K, Jin X, Li Q, et al. Propolis from Different Geographic Origins Suppress Intestinal Inflammation in a Model of DSS-Induced Colitis is Associated with Decreased Bacteroides spp. in the Gut.[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2018, 62(17):1800080-.

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