單細胞測序揭示慢性淋巴細胞白血病的免疫抑制機制

研究背景

慢性淋巴細胞白血?。–LL）會導致患者機體感染易感性增加，但并非均與T細胞功能障礙有關，因此，識別具有T細胞缺陷的CLL患者非常重要。前期研究已證明基因BCL-2在CLL中具有重要作用，但尚無研究證明其在CLL患者T細胞中的作用。本研究確定了BCL-2在CLL腫瘤微環(huán)境中T細胞中的調節(jié)作用。

研究材料

材料：6名CLL患者和2名健康人的血液樣本，臨床信息如下

方法：單細胞轉錄組測序

研究成果

1、CD4+ T細胞中BCL-2的表達與Treg的激活和增殖有關

單細胞測序共得到16個細胞群，其中cluster6被鑒定為CD4+ T細胞（圖1a）。使用limma包分析BCL2陽性和陰性細胞中的基因表達，并使用熱圖和火山圖繪制差異表達基因（DEG）（圖1b，c）。KEGG富集分析表明，DEGs主要富集與“細胞粘附”相關的信號通路，包括“細胞-細胞粘附的調節(jié)”和“白細胞-細胞粘附的調節(jié)”，除此以外還包括“T 細胞活化”（圖1d）。

DEG的GSEA表明BCL2+?T細胞的Treg數(shù)量增加。此外，BCL2+?T細胞中的Treg多于BCL2-?T細胞（圖2e，f）。GSVA分析顯示BCL2+?T細胞具有“IL-6相關特征”和“T細胞激活相關特征”（圖2g）。GSEA分析觀察到BCL2+?T細胞主要參與EGFR/MEK信號通路（圖2h）。最后，分析了BCL2+?T細胞的代謝特征，發(fā)現(xiàn)BCL2+?T細胞可能與“缺氧抑制因子（HIF）調節(jié)基因”和“糖原代謝基因”有關（圖2i）。

2、CD8+?T細胞中的BCL2表達與細胞毒性T淋巴細胞耗竭增加有關

Cluster 8被鑒定為CD8+?T細胞，比較了BCL2陽性和陰性CD8+?T細胞之間的基因表達（圖3a-c）。KEGG富集分析表明，DEG富集在T細胞活化和細胞-細胞粘附相關的信號通路上，并且BCL2在CD8+?T細胞中的表達可能與細胞遷移、細胞毒性有關（圖3d）。 CD8+?T細胞中的BCL2表達顯示出T細胞衰竭特征。發(fā)現(xiàn)BCL2+?T細胞中耗竭CD8+ T細胞的數(shù)量顯著增加，表明BCL2+?CD8+?T細胞的轉錄譜與耗竭T細胞相似（圖3e，f）。TF預測分析與CD4+?T細胞結果相似，這表明CD4+和CD8+ T細胞可能共享相同的上游信號通路（圖3g）。代謝特征分析發(fā)現(xiàn)HIF調節(jié)基因和磷酸戊糖途徑基因與BCL2+?CD8細胞相關（圖3h）。

3、BCL-2表達與CLL患者的Th1降低和Treg升高有關

收集了70名CLL患者的PBMC樣本。首先，在T細胞中檢測BCL-2表達，包括T1、T2、T17、T22、Tregs和濾泡輔助T細胞（Tfh），發(fā)現(xiàn)BCL-2+的T1細胞百分比顯著降低（圖4a）；T2、T17、T22和Tfh細胞顯著升高（圖4b-e），T細胞中BCL-2表達對Tregs的影響較大（圖4f）。研究發(fā)現(xiàn)T細胞中的BCL-2表達可以影響T亞群。

4、BCL-2+?CD4+ Treg中IL-10和TGF-β上調

TGF-β在幼稚CD4+細胞分化為Treg的過程中至關重要，對于維持Treg穩(wěn)態(tài)也很重要。研究發(fā)現(xiàn)與BCL-2-Treg相比，BCL-2+ Treg中IL-10和TGF-β的MFI顯著增加（圖5a-d），然而IL-35+和TGF-β+沒有統(tǒng)計學差異，而BCL-2+ Tregs可以分泌更多的IL- 35和TGF-β（圖5d，f）。

5、BCL-2促進CLL患者的細胞耗竭并降低CD8+T細胞的細胞毒性

在70名CLL患者中研究了CD8+ T細胞BCL-2表達與其耗竭和細胞毒性之間的關聯(lián)，結果發(fā)現(xiàn)BCL-2+細胞中耗竭CD8+T細胞的比例和MFI顯著高于BCL-2-T細胞（圖6a，b）。 除了導致T細胞耗竭之外，BCL-2表達增加與顆粒酶B和穿孔素的表達減少有關。此外，CD8+ BCL-2+ T細胞中顆粒酶B陽性的百分比降低，而穿孔素在CD8 +BCL-2+ T細胞保持不變，但CD8+BCL-2+ T細胞中顆粒酶B和穿孔素的MFI水平高于CD8+BCL-2-T細胞（圖6c-f）。

6、BCL-2改變CLL患者的T細胞分化

一般來說，T細胞的分化根據(jù)CD45RA和CD62L的表達可分為四個階段，幼稚T細胞（Tn、CD45RA+CD62L+）、效應T細胞（Tef、CD45RA+CD62L-）、效應記憶T細胞 （Tem，CD45RA-CD62L-）和中央記憶T細胞（Tcm，CD45RA-CD62L+）（圖7a，b）。對每個T細胞亞群中BCL-2的表達進行分析，結果表明BCL-2+ T細胞中幼稚T細胞的比例高于BCL-2- T細胞（圖7c，d）。此外，BCL-2+ T細胞中Tem和Tcm的比例低于BCL-2- T細胞。

7、CR患者中BCL-2+ T細胞的頻率和恢復功能降低

比較了來自12名匹配的venetoclax治療前后的CLL患者外周T細胞的BCL-2表達和功能（圖8a-e），發(fā)現(xiàn)venetoclax顯著降低了CLL患者中CD4+BCL-2+和CD8+BCL-2+ T細胞的占比（圖8f，g）。 此外，venetoclax處理后，CD4+ T細胞中Tregs和CD8+ T細胞中PD1+Tim-3+細胞的百分比顯著降低（圖8h，i）。這些結果表明，外周T細胞中BCL-2的表達是預測治療反應的潛在指標。

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研究結論

本研究揭示了BCL-2在CLL患者T細胞中的作用，發(fā)現(xiàn)BCL-2通過增強Treg分化和CTL細胞耗竭來促進免疫抑制。研究還確定了使用BCL-2抑制劑venetoclax治療CLL的新策略，并為恢復T細胞功能提供了新的思路。

 

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