自1977年Sanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法測(cè)序技術(shù)以來(lái)，新的測(cè)序技術(shù)、測(cè)序平臺(tái)不斷涌現(xiàn)。目前，三代測(cè)序技術(shù)已憑借其技術(shù)優(yōu)勢(shì)受到越來(lái)越多科研工作者的青睞。三代測(cè)序技術(shù)集長(zhǎng)讀長(zhǎng)和高通量于一身，對(duì)高純度、長(zhǎng)讀長(zhǎng)核酸分子進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)序，此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究及精準(zhǔn)醫(yī)療中。三代測(cè)序的代表為Oxford Nanopore Technologies（ONT）和PicBio（PB）這兩大測(cè)序平臺(tái)，下面就這兩個(gè)平臺(tái)與大家說(shuō)道說(shuō)道：
測(cè)序原理
ONT測(cè)序?qū)⑷斯ず铣傻囊环N多聚合物的膜浸在離子溶液中，多聚合物膜上布滿了經(jīng)改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白（納米孔），也就是Reader蛋白，在膜兩側(cè)施加不同的電壓產(chǎn)生電壓差，DNA鏈在馬達(dá)蛋白的牽引下，解螺旋通過(guò)納米孔蛋白，不同的堿基會(huì)形成特征性離子電流變化信號(hào)，通過(guò)對(duì)這些信號(hào)的檢測(cè)，得到堿基序列，完成測(cè)序。
PB的測(cè)序空間為ZMW（zero-mode wave guides，零模波導(dǎo)孔），外徑100多納米，DNA分子掉入孔中，不同熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸在聚合酶的作用下，會(huì)產(chǎn)生不同的熒光信號(hào)，隨后標(biāo)記基團(tuán)自動(dòng)脫落，維持了信號(hào)的持續(xù)監(jiān)測(cè)。激光從ZMW底部打入，由于孔直徑很小而不能穿過(guò)孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，從而把背景噪音降到最低。
由此，ONT的納米孔是指膜上的納米孔通道蛋白，PB的納米孔為ZMW孔，在“方寸之地”完成測(cè)序。
PB測(cè)序
ONT測(cè)序
測(cè)序儀器
ONT平臺(tái)：MinION、GridION X5、PromethION；具體區(qū)別如下：
PB平臺(tái)：RSII和Sequel系列儀器，目前Sequel系列平臺(tái)測(cè)序通量高、單Gb數(shù)據(jù)成本低、周期短的特點(diǎn)已將RSII平臺(tái)取代。
2平臺(tái)發(fā)展前景！
ONT平臺(tái)在軟、硬件及建庫(kù)技術(shù)等各方面不斷升級(jí)優(yōu)化，如推出的R10測(cè)序芯片，將單堿基電流信號(hào)判讀率提升到2次，數(shù)據(jù)質(zhì)量方面將會(huì)有了明顯改善，由于小編未有足夠的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)，目前就不做分享了。
目前PacBio推出Sequel II測(cè)序平臺(tái)，其單張芯片測(cè)序通量較Sequel平臺(tái)提升了8倍左右。
建庫(kù)方式
ONT平臺(tái)：在DNA測(cè)序方面，利用片段篩選，非片段篩選和片段打斷3種方式對(duì)DNA樣品進(jìn)行1D建庫(kù)。
片篩即利用Bluepippin對(duì)DNA樣品進(jìn)行片段篩選，并依據(jù)科研人員的實(shí)際研究需求梯度富集回收大片段用于建庫(kù)測(cè)序。非片段篩選即DNA提取后，未經(jīng)過(guò)片段篩選的過(guò)程，直接進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。片段打斷即利用g-TUBE將DNA片段打斷成20kb或其它大小的片段，這種技術(shù)在一定程度上可提升單cell產(chǎn)量，其可應(yīng)用于個(gè)體重測(cè)序、甲基化等研究。倘若您想組裝基因組，小編還是建議使用片段篩選的方式，富集大片段進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序，經(jīng)過(guò)片段篩選后，會(huì)有更大比例的長(zhǎng)片段DNA分子穿過(guò)納米孔，這樣得到的測(cè)序讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)相較于其它建庫(kù)方式會(huì)普遍變長(zhǎng)。
PB平臺(tái)：在DNA測(cè)序方面，PB一般使用g-TUBE將DNA片段打斷成20kb或30kb的文庫(kù)，對(duì)打斷的DNA樣品進(jìn)行末端修復(fù)，連接啞鈴型的接頭，使用Bluepippin進(jìn)行片段篩選，獲得測(cè)序文庫(kù)。
以O(shè)NT的片篩文庫(kù)和PB的文庫(kù)比較，由于PB經(jīng)過(guò)了片段打斷，且受DNA聚合酶活性的影響，在讀長(zhǎng)方面稍遜色于ONT平臺(tái)。以下就對(duì)它倆的測(cè)序數(shù)據(jù)做一比較。
測(cè)序數(shù)據(jù)
數(shù)據(jù)讀長(zhǎng)比較，后3列依次是Read_N50，平均長(zhǎng)度和最長(zhǎng)reads大小，單位都是bp哦。。。。
以某物種為例，我們看看各片段的分布：
總結(jié)：從這份數(shù)據(jù)可以看出，PB 平臺(tái)18K以上的數(shù)據(jù)占39.6%，Nanopore平臺(tái)20K以上的數(shù)據(jù)可達(dá)68%。
數(shù)據(jù)糾錯(cuò)
ONT平臺(tái)和PB平臺(tái)下機(jī)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率一般85%左右，后期Canu軟件進(jìn)行Reads糾錯(cuò)，應(yīng)用Reads間去比對(duì)最長(zhǎng)的Reads(一般后期應(yīng)用30-50×的數(shù)據(jù)用于基因組組裝)，數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率有了大幅度提升。ONT平臺(tái)應(yīng)用smart、Canu、wtbdg等 3款軟件進(jìn)行組裝，racon兩輪糾錯(cuò)（三代數(shù)據(jù)），pilon三輪糾錯(cuò)（2代數(shù)據(jù)）后，可將基因組的準(zhǔn)確率提升至99.99%。PB平臺(tái)一般應(yīng)用smart、Canu、wtbdg、Falcon 4款軟件進(jìn)行組裝，arrow糾錯(cuò)（三代數(shù)據(jù)），pilon三輪糾錯(cuò)（2代數(shù)據(jù)）后，可將基因組的準(zhǔn)確率提升至99.999%。
總述
PB、ONT各有千秋，各具特色。目前百邁客已完成三代測(cè)序平臺(tái)的完整搭建，并集提取、建庫(kù)、測(cè)序于一體，可滿足科研工作者的不同測(cè)序需求；
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